製品
ライフコズム SARS-Cov-2-RT-PCR 検出キット（2019-nCoV用）
想定される使用方法
このキットは、咽頭スワブ、鼻咽頭スワブ、気管支肺胞洗浄液、痰を使用して、新しいコロナウイルス（2019-nCoV）の定性的な検出に使用されます。この製品の検出結果は臨床参考用であり、臨床診断および治療の唯一の証拠として使用しないでください。患者の臨床症状と他の臨床検査と組み合わせて、病状の包括的な分析が推奨されます。
検査原則
本キットはワンステップRT-PCR技術を基盤としています。増幅対象領域として、2019年新型コロナウイルス（2019-nCoV）のORF1ab遺伝子とN遺伝子を選択しました。特異的プライマーと蛍光プローブ（N遺伝子プローブはFAM標識、ORF1abプローブはHEX標識）を用いて、サンプル中の2019年新型コロナウイルスRNAを検出します。また、本キットには内因性内部コントロール検出システム（CY5標識内部コントロール遺伝子プローブ）が含まれており、サンプル採取、RNA増幅、PCR増幅のプロセスをモニタリングすることで、偽陰性結果を低減します。
主なコンポーネント
| コンポーネント | 音量（48T/キット） |
| RT-PCR反応溶液 | 96µl |
| nCOVプライマーTaqManプローブ混合物（ORF1ab,N Gene,RnaseP Gene） | 864µl |
| ネガティブコントロール | 1500µl |
| nCOV 陽性対照（l ORF1ab N 遺伝子） | 1500µl |
自社試薬：RNA抽出または精製試薬。陰性対照／陽性対照：陽性対照は標的断片を含むRNA、陰性対照は核酸を含まない水。使用中は抽出に関与し、感染性があると考えられるため、関連規制に従って取り扱い、廃棄してください。
内部参照遺伝子はヒト RnaseP 遺伝子です。
保管条件と有効期限
-20±5℃、5回以上の凍結融解の繰り返しを避けてください。有効期間は6か月です。
適用可能な機器
FAM / HEX / CY5などのマルチチャンネル蛍光PCR装置を搭載。
標本の要件
1.適用検体：咽頭スワブ、鼻咽頭スワブ、気管支肺胞洗浄液、痰。
2.検体採取（無菌操作）
咽頭スワブ：2本のスワブを同時に使用して扁桃腺と咽頭後壁を拭き、スワブの先端をサンプル溶液の入った試験管に浸します。
痰：患者が激しい咳をした後、採取液を入れたスクリューキャップ付き試験管に痰を採取する。気管支肺胞洗浄液：医療従事者による採取。3.サンプルの保管と輸送
ウイルス分離およびRNA検査のための検体は、できるだけ早く検査する必要があります。24時間以内に検出できる検体は4℃で保存できますが、24時間以内に検出できない検体は
時間は-70℃以下で保管してください（-70℃の保管条件がない場合は、
検体は-20℃の冷蔵庫で一時的に保管されます。輸送中は凍結と解凍を繰り返さないようにしてください。採取後、できるだけ早く検査室に送付してください。長距離輸送が必要な場合は、ドライアイスでの保管をお勧めします。
試験方法
1 サンプル処理とRNA抽出（サンプル処理エリア）
RNA抽出には200μlの液体サンプルを採取することをお勧めします。抽出手順については、市販のRNA抽出キットの説明書を参照してください。陰性サンプルと陰性サンプルの両方が
このキットのコントロールは抽出に使用されました。
2 PCR試薬調製（試薬調製エリア）
2.1 キットからすべての成分を取り出し、室温で解凍・混合します。使用前に8,000 rpmで数秒間遠心分離し、必要な試薬量を計算し、以下の表に示すように反応系を調製します。
| コンポーネント | Nサービング（25µlシステム） |
| nCOV プライマー TaqMan プローブ混合物 | 18µl × N |
| RT-PCR反応溶液 | 2µl × N |
| *N = 検査したサンプル数 + 1 (陰性対照) + 1 (nCOV陽性対照） | |
2.2 成分をよく混ぜた後、短時間遠心分離してチューブ壁の液体をすべてチューブの底に落とし、20 µl の増幅システムを PCR チューブに分注します。
3 サンプリング（試料調製エリア）
抽出後、陰性コントロールと陽性コントロールをそれぞれ5μlずつ加えます。検査対象サンプルのRNAをPCR反応チューブに加えます。
チューブをしっかりと蓋をして、8,000 rpm で数秒間遠心分離してから、増幅検出領域に移します。
4 PCR増幅（増幅検出領域）
4.1 反応チューブを装置のサンプルセルに配置し、次のようにパラメータを設定します。
| ステージ | サイクル 番号 | 温度（℃） | 時間 | コレクションサイト |
| 逆行する転写 | 1 | 42 | 10分 | - |
| 変性前n | 1 | 95 | 1分 | - |
| サイクル | 45 | 95 | 15秒 | - |
| 60 | 30代 | データ収集 |
機器検出チャンネルの選択：蛍光信号にはFAM、HEX、CY5チャンネルを選択してください。参照蛍光NONEの場合はROXを選択しないでください。
5 結果分析（設定については各機器の実験説明書を参照してください）
反応後、結果を保存します。分析後、画像に応じてベースラインの開始値、終了値、閾値を調整します（ユーザーは実際の状況に応じて調整でき、開始値は3〜15、終了値は5〜20に設定できます）。対数グラフウィンドウの閾値では、閾値線は対数位相にあり、ネガティブコントロールの増幅曲線は直線または閾値線を下回っています。
6 品質管理（手順管理はテストに含まれている）ネガティブコントロール：FAM、HEX、CY5検出チャンネルで明らかな増幅曲線がない
COV 陽性コントロール: FAM および HEX 検出チャネルの増幅曲線が明らかで、Ct 値≤32 ですが、CY5 チャネルの増幅曲線は見られません。
上記の要件は同じ実験で同時に満たされる必要があります。そうでない場合、実験は無効となり、繰り返す必要があります。
7 結果の決定。
7.1 検査サンプルのFAMおよびHEXチャネルに増幅曲線またはCt値> 40がなく、CY5チャネルに増幅曲線がある場合、サンプル中に2019新型コロナウイルス（2019-nCoV）RNAが存在しないと判断できます。
.2 検査サンプルのFAMおよびHEXチャネルに明らかな増幅曲線があり、Ct値が40以下の場合、サンプルは2019年新型コロナウイルス（2019-nCoV）陽性であると判断できます。
7.3 検査サンプルがFAMまたはHEXのいずれか一方のチャネルでのみ明確な増幅曲線を示し、Ct値が40以下で、もう一方のチャネルでは増幅曲線が見られない場合、結果を再検査する必要がある。再検査結果が一致すれば、サンプルは新規検査で陽性と判定できる。
新型コロナウイルス2019（2019-nCoV）の再検査結果が陰性であれば、検体は2019年新型コロナウイルス（2019-nCoV）陰性と判断されます。
肯定的な判断値
ROC 曲線法を使用してキットの参照 CT 値と内部コントロール参照値が 40 であると決定されます。
テスト結果の解釈
1. 各実験は、陰性対照と陽性対照について試験する必要があります。試験結果は、対照が品質管理要件を満たしている場合にのみ決定されます。
2. FAM および HEX 検出チャネルが正の場合、システムの競合により、CY5 チャネル (内部制御チャネル) の結果が負になることがあります。
3. 内部コントロールの結果が陰性で、試験管のFAMおよびHEX検出チャネルも陰性の場合、システムが故障しているか操作に誤りがあり、検査が無効であることを意味します。したがって、サンプルを再検査する必要があります。
