製品
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR 2019-nCoV 検出キット
想定される用途
このキットは、咽頭ぬぐい液、鼻咽頭ぬぐい液、気管支肺胞洗浄液、喀痰を使用した新型コロナウイルス（2019-nCoV）の定性的検出に使用されます。この製品の検出結果は臨床参考のみを目的としており、唯一の目的として使用しないでください。臨床診断と治療の証拠。患者の臨床症状や他の臨床検査と組み合わせて、状態を包括的に分析することが推奨されます。
検査原理
このキットはワンステップ RT-PCR 技術に基づいています。実際、2019年の新型コロナウイルス(2019-nCoV)のORF1ab遺伝子とN遺伝子が増幅対象領域として選択されました。特定のプライマーと蛍光プローブ（N 遺伝子プローブは FAM で標識され、ORF1ab プローブは HEX で標識されています）は、サンプル中の 2019 新型コロナウイルス RNA を検出するように設計されています。このキットには、サンプル収集、RNA、および PCR 増幅のプロセスを監視するための内因性内部対照検出システム (CY5 で標識された内部対照遺伝子プローブ) も含まれているため、偽陰性の結果が減少します。
メインコンポーネント
| コンポーネント | 音量（48T/キット） |
| RT-PCR反応液 | 96μl |
| nCOVプライマーTaqManプローブ混合物（ORF1ab,N Gene,RnaseP Gene） | 864μl |
| ネガティブコントロール | 1500μl |
| nCOV 陽性対照（l ORF1ab N 遺伝子） | 1500μl |
独自の試薬: RNA 抽出または精製試薬。ネガティブ/ポジティブコントロール: ポジティブコントロールは標的フラグメントを含むRNAであり、ネガティブコントロールは核酸を含まない水です。使用中、それらは抽出に関与する必要があり、感染性があると考えられる必要があります。これらは関連する規制に従って取り扱い、廃棄する必要があります。
内部参照遺伝子はヒト RnaseP 遺伝子です。
保管条件と使用期限
-20±5℃、凍結融解を5回以上繰り返さないでください。有効期限は6ヶ月です。
適用機器
FAM / HEX / CY5 およびその他のマルチチャンネル蛍光 PCR 装置を使用します。
検体の要件
1.適用可能な検体の種類：咽頭ぬぐい液、鼻咽頭ぬぐい液、気管支肺胞洗浄液、喀痰。
2.検体採取（無菌法）
咽頭スワブ: 2 つのスワブで扁桃腺と咽頭後壁を同時に拭き、サンプリング溶液が入った試験管にスワブの先端を浸します。
喀痰: 患者が深い咳をした後、咳嗽した喀痰をサンプリング溶液の入ったねじ口試験管に採取します。気管支肺胞洗浄液：医療専門家によるサンプリング。3.サンプルの保管と輸送
ウイルス分離および RNA 検査のための検体は、できるだけ早く検査する必要があります。24時間以内に検出できる検体は4℃で保存可能です。24時間以内に検出できないもの
-70℃以下で数時間保管してください（-70℃の保管条件がない場合は、-70℃以下で保管してください）
-20℃の冷蔵庫で一時保存）。検体は輸送中に凍結と融解を繰り返さないようにしてください。検体は採取後できるだけ早く研究室に送る必要があります。サンプルを長距離輸送する必要がある場合は、ドライアイス保管をお勧めします。
試験方法
1 サンプル処理とRNA抽出（サンプル処理エリア）
RNA 抽出には 200μl の液体サンプルを採取することをお勧めします。関連する抽出手順については、市販の RNA 抽出キットの説明書を参照してください。ネガティブもネガティブも
このキットのコントロールは抽出に関与していました。
2 PCR試薬調製（試薬調製エリア）
2.1 キットからすべてのコンポーネントを取り出し、室温で解凍して混合します。使用前に 8,000 rpm で数秒間遠心分離します。必要な試薬量を計算し、下表のように反応系を準備します。
| コンポーネント | N サービング (25μl システム) |
| nCOV プライマー TaqMan プローブ混合物 | 18μl×N |
| RT-PCR反応液 | 2μl×N |
| *N = 検査したサンプル数 + 1 (陰性対照) + 1 (nCOV)ポジティブコントロール） | |
2.2 成分を完全に混合した後、短時間遠心分離してチューブ壁上のすべての液体をチューブの底に落とし、その後 20 μl の増幅システムを PCR チューブに分注します。
3 サンプリング（試料調製エリア）
抽出後、5μlのネガティブコントロールとポジティブコントロールを加えます。検査対象のサンプルの RNA を PCR 反応チューブに加えます。
チューブにしっかりと蓋をし、8,000 rpm で数秒間遠心分離してから、増幅検出エリアに移します。
4 PCR増幅（増幅検出領域）
4.1 反応チューブを装置のサンプルセルに配置し、パラメータを次のように設定します。
| ステージ | サイクル 番号 | 温度(℃) | 時間 | コレクションサイト |
| 逆行する転写 | 1 | 42 | 10分 | - |
| 変性前n | 1 | 95 | 1分 | - |
| サイクル | 45 | 95 | 15秒 | - |
| 60 | 30代 | データ収集 |
機器検出チャンネル選択：蛍光信号のFAM、HEX、CY5チャンネルを選択します。参考蛍光NONEの場合はROXを選択しないでください。
5 結果の解析（設定については各装置の実験説明書を参照してください）
反応後、結果を保存します。分析後、イメージに応じてベースラインの開始値、終了値、しきい値を調整します（ユーザーは実際の状況に応じて調整でき、開始値は3〜15に設定でき、終了値は〜に設定できます）対数グラフの(5~20、調整)) ウィンドウの閾値では、閾値ラインは対数位相にあり、ネガティブコントロールの増幅曲線は直線または閾値ライン以下です)。
6 Quautyコントロール（試験には手順コントロールが含まれます） ネガティブコントロール：FAM、HEX、CY5検出チャンネルの明らかな増幅曲線なしn
COV 陽性コントロール: FAM および HEX 検出チャネルの明らかな増幅曲線、Ct 値 ≤ 32、ただし CY5 チャネルの増幅曲線はありません。
上記の要件は、同じ実験で同時に満たされる必要があります。そうでない場合、実験は無効となるため、繰り返す必要があります。
7 結果の判定。
7.1 検査サンプルのFAMおよびHEXチャンネルに増幅曲線が存在しないか、またはCt値＞40であり、CY5チャンネルに増幅曲線が存在する場合、2019年新型コロナウイルス（2019-nCoV）は存在しないと判断できるサンプル中のRNA。
.2 検査サンプルの FAM および HEX チャネルに明らかな増幅曲線があり、Ct 値が 40 以下の場合、サンプルは 2019 年の新型コロナウイルス (2019-nCoV) に対して陽性であると判断できます。
7.3 検査サンプルの FAM または HEX の 1 つのチャネルにのみ明確な増幅曲線があり、Ct 値が ≤40 で、もう 1 つのチャネルに増幅曲線がない場合、結果を再検査する必要があります。再検査の結果が一致していれば、サンプルは新たな検査に対して陽性であると判断できます。
コロナウイルス 2019 (2019-nCoV)。再検査の結果が陰性であれば、その検体は2019年新型コロナウイルス（2019-nCoV）に対して陰性であると判断できます。
正の判定値
ROC 曲線法を使用してキットの基準 CT 値を決定し、内部対照基準値は 40 です。
テスト結果の解釈
1.各実験は陰性対照と陽性対照についてテストする必要があります。テスト結果は、コントロールが品質管理要件を満たしている場合にのみ決定できます。
2.FAM および HEX 検出チャネルが正の場合、システム競合により CY5 チャネル (内部制御チャネル) の結果が負になる場合があります。
3. 内部制御結果が陰性で、試験管の FAM および HEX 検出チャンネルも陰性の場合、システムが無効になっているか、操作が間違っていることを意味し、試験は無効です。したがって、サンプルを再検査する必要があります。
